不同強度的運動聯(lián)合葛根素對非酒精性脂肪肝大鼠模型的**及其機制研究
冷超1，2 ，李大威1 ，李強2
( 1． 哈爾濱學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086; 2． 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院，黑龍江 哈爾濱 150086)
摘 要: 目的: 研究不同強度的運動聯(lián)合葛根素對非酒精性脂肪肝( NAFLD) 大鼠模型的**作用和機制。方法: 調(diào)節(jié)動物跑步機按照 10、15、20 m / min 3 種運動強度將大鼠分為低強度運動組、中等強度運動組和高強度運動組。運動組和**組中的大鼠均給予 250 mg / kg 葛根素日 1 次灌胃; 除了對照組外，各組大鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng) 4 周。在 4 周末，檢測大鼠體質(zhì)量和肝臟重量; 檢測血漿中透明質(zhì)酸( HA) 、層黏連蛋白( LN) 、三型前膠原( PCⅢ) 、四型膠原( Ⅳ － C) 、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶( ALT) 、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶( AST) ; 總膽固醇( TC) 、甘油三酯( TG) 、高密度脂蛋白( HDL － C) 、低密度脂蛋白( LDL － C) 、游離脂肪酸( FFA) 和瘦素( Leptin) 的濃度; 檢測肝臟組織中超氧化物歧化酶( SOD) 和丙二醛( MDA) 的含量; 制作肝臟病理切片檢測脂肪肝病變情況。結(jié)果: 高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng) 4 周能形成 NAFLD 大鼠模型。各運動組中體質(zhì)量變化和肝臟指數(shù)均低于模型組( P ＜ 0. 05) ; 運動組和**組與模型組相比 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ － C、ALT 和 AST 明顯降低( P ＜ 0. 05) ; 運動組中和**組與模型組相比 TC、TG、LDL － C、FFA 和 Leptin 明顯降低，而HDL － C 明顯升高( P ＜ 0. 05) ; 中等強度和高強度運動組中肝組織內(nèi)無脂肪沉積。結(jié)論: 葛根素可以降低血脂，改善肝臟功能，但不能減輕 NAFLD 程度; 中等強度運動和高強度運動聯(lián)合葛根素可以降低血脂、改善胰島素抵抗癥狀、改善肝臟功能和防止 NAFLD 的發(fā)生隨著人民群眾物質(zhì)生活水平的提高，非酒精性脂肪肝 ( non － alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 也呈現(xiàn)逐步增加的態(tài)勢。NAFLD 是指除酒精因素外，導(dǎo)致肝細胞出現(xiàn)脂肪變性為特點的臨床綜合征，NAFLD 可以分為單純性脂肪肝和脂肪性肝炎兩種類型，而后者可以進一步發(fā)展并形成肝纖維化甚至是肝硬化［1 － 2］。研究顯示，NAFLD 與糖尿病、高脂血癥、胰島素抵抗、代謝綜合征等**和癥狀密切相關(guān)。NAFLD 的成因不明，目前研究認為除了跟環(huán)境和遺傳等因素有關(guān)外，飲食習(xí)慣也起到了關(guān)鍵作用［3］。NAFLD 的發(fā)病隱匿且病程長，由于肝臟的代償功能強，因此在NAFLD 發(fā)病早期肝臟功能無異常表現(xiàn)，而當(dāng)肝臟功能進入失代償期時，往往脂肪肝已發(fā)展為脂肪性肝纖維化，病情已不可逆轉(zhuǎn)，嚴重威脅到人體的健康。
目前，** NAFLD 方案主要有 3 種，控制飲食、****和合理運動［4］。****包括**yao如奧利司他、西布 曲明等，胰島素增敏劑如二甲雙胍和格列齊特等，降血脂藥 物非諾貝特和他汀類**等［5］。上述**雖然可以有效 的降低血脂，但**的不佳反應(yīng)較大，對改善脂肪肝的效果 不明顯。運動作為 NAFLD 的非**療法，具有費用小，節(jié)約開支，實施方便的特點，而且適度的有規(guī)律的運動可以改 善機體對胰島素敏感性，延緩 NAFLD 的發(fā)展并*終改善患者的生存質(zhì)量，但單純的運動對降低血脂、改善體內(nèi)脂肪代 謝紊亂收效甚微。
葛根為常用中藥，取材方便，價格低廉。對葛根的記載始于《神農(nóng)本草經(jīng)》: “味甘，主消渴身大熱嘔吐諸痹，起陰氣，解諸毒。葛谷，主下利，十歲已上。一名雞齊根。生川谷?！?，其具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉的功效，多用于**外感發(fā)熱、口渴、斑疹不透、熱痢、脾虛泄瀉、高血壓、 **項強等癥?，F(xiàn)代分析化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)葛根中有效成分的包括大豆苷、染料木苷、大豆素和葛根素等異黃酮類化合物［6］。葛根素作為中藥葛根中的組要成分之一，具有改善心血管功能、保護血管內(nèi)皮細胞、降低血糖和改善胰島素抵抗的癥狀。鑒于NAFLD 多伴有高血脂和胰島素抵抗癥狀， 因此本研究通過不同強度運動聯(lián)合葛根素** NAFLD 大鼠模型，觀察各組中血脂變化、胰島素抵抗改善情況和肝臟功能及病理的變化，為臨床上尋找** NAFLD ****和制定科**動計劃供實驗依據(jù)。
1 材料與方法
1． 1 實驗材料
1． 1． 1 實驗動物 雄性 Sprague － Dawley( SD) 大鼠 48 只， 6 周齡，體質(zhì)量 180 ～ 200 g，購買于哈爾濱獸醫(yī)研究所。大鼠自購入后飼養(yǎng)于動物盒內(nèi)，4 ～ 5 只放置在 1 盒內(nèi)，自然光照，自由飲水，每 2 天更換墊料 1 次，保持盒內(nèi)的環(huán)境清潔。
1． 1． 2 實驗試劑和儀器 葛根素購買于西安瑞林生物科技有限公司( 生產(chǎn)品號 201501342) ; 高脂飼料( 飼料配方: 豬油 30% 、蔗糖 8% 、酪蛋白 25% 、豆油 3% 、纖維素 7% 、礦物質(zhì) 7% 、糊精 20% ) ; ALT、AST 購買于北京中生北控生物科技股份有限公司; HA、LN、PCⅢ、Ⅳ －C 檢測試劑盒購自上海研晶生物科技有限公司; TC 、TG、HDL － C 和 LDL － C 檢測試劑盒購自四川邁克生物科技有限公司; SOD、MDA 和 FFA 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所; Leptin ELISA 試劑盒購自盒購自美國 Cloud － Clone 公司; 實驗所用分析純均購買于國藥集團; TBA － 40FR 全自動生化檢測儀購買于日本東芝公司; 721 分光光度計購買于上海精密科學(xué)儀器廠; 快速血糖監(jiān)測儀購買于美國強生公司( 內(nèi)含監(jiān)測試紙) ; DB030 型動物跑步機購買于北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。
1． 2 實驗方法
取 48 只雄性 SD 大鼠，隨機分為 6 組，每組 8 只。調(diào)節(jié)動物跑步機按照 10、15、20 m / min 三種運動強度將大鼠分為低強度運動組、中等強度運動組和高強度運動組并采用250 mg / kg 葛根素日1 次給予各運動組動物灌胃，同時采用高脂飼料飼養(yǎng) 4 周。運動組的訓(xùn)練方式按照文獻進行: 低強度運動組按照 10 m / min 進行跑步鍛煉，每天進行 1 h 直至 4 周末; 中等強度運動組按照 15 m / min 進行跑步鍛煉， 每天進行 1 h 直至 4 周末;高強度運動組按照 20 m / min 進行跑步鍛煉，每天進行 1 h 直至 4 周末。采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠 4 周建立模型組，并在第 4 周末檢測 NAFLD 大鼠模型是否成功。葛根素 250 mg / kg 灌胃同時給予高脂飼料喂養(yǎng)大鼠 4 周建立**組。對照組給予普通飼料喂養(yǎng) 4 周。記錄各組大鼠在實驗前的體質(zhì)量和第 4 周末實驗結(jié)束時的體質(zhì)量，計算大鼠體質(zhì)量平均每周變化的重量。
1． 3 標(biāo)本采集
各組實驗大鼠在第 4 周通過水合氯醛麻醉大鼠后，通過腹主動脈采血，檢測血漿中 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ － C、ALT、 中
AST、TC、TG、HDL － C、LDL － C、FFA 和 Leptin 的濃度。取華中出大鼠的肝臟，經(jīng)過稱量后計算肝臟指數(shù); 取肝臟小葉約 1 醫(yī)g，用生理鹽水沖，去處殘留血液。在勻漿器加入生理鹽水， 藥將肝組織研磨成 0． 5% 、1% 和 10% 的混懸液，在 4000 r /min 離心 15 min，取上清液按照 SOD 和MDA 試劑盒檢測小學(xué)鼠肝組織內(nèi)SOD 和MDA 的活性; 將部分肝臟用 5% 的福爾刊馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，對肝組織進行 HE 染色，觀察大鼠肝臟病理變化。
11. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理
實驗數(shù)據(jù)用過 SPSS 15 統(tǒng)計軟件處理。以計量資料結(jié)果采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，組間比較采用 t 檢驗，P＜ 0. 05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 不同運動強度對 NAFLD 大鼠體質(zhì)量變化和肝臟指數(shù)的影響將大鼠處死后取出肝臟并稱重，按照公式計算: 肝臟的重量/ 大鼠的重量 = 肝臟指數(shù)。結(jié)果顯示，模型組與對照組相比肝臟指數(shù)具和體質(zhì)量變化有顯著性差異( P ＜ 0. 05) ; 低強度運動組、中等強度運動組和高強度運動組與模型組 相比肝臟指數(shù)和體質(zhì)量變化具有顯著性差異( P ＜ 0. 05) 。見表 1。
2． 2 不同運動強度對 NAFLD 大鼠肝功能指標(biāo)的影響與對照組相比，模型組中的 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ － C、ALT 和 AST 明顯增高 ( P ＜ 0. 05) ; 與模型組相比，低強度運動組、中等強度運動組和高強度運動組 3 組中的 HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ － C、ALT 和 AST 明顯升低( P ＜ 0. 05) 。見表 2。
2． 3 不同運動強度對 NAFLD 大鼠血脂、瘦素和游離脂肪酸水平的影響與對照組相比，模型組中的 TC、TG、LDL － C、FFA 和Leptin 明顯增高，而 HDL － C 明顯降低( P ＜ 0. 05) ; 與模型組相比，其余各組中的 TC、TG、LDL － C、FFA 和 Leptin 明顯降低，而 HDL － C 明顯升高( P＜ 0. 05) 。見表 3。
2． 4 大鼠肝臟病理變化
對照組中，肝小葉形狀規(guī)則完整，肝竇正常，肝細胞排 列整齊，呈條索狀排列，肝細胞呈多邊形，核圓，位于細胞的 中央，細胞質(zhì)均勻( 插頁ⅩⅩⅨ圖 1) ; 模型組中可見肝小葉形狀欠規(guī)則，肝細胞排列不規(guī)則，肝細胞體積明顯增大，部分 細胞輕度水樣變性，在肝細胞質(zhì)內(nèi)有大量的脂滴空泡，細胞 核偏向一側(cè)( 插頁ⅩⅩⅨ圖 2) ; **組中可見肝小葉形狀欠規(guī)則，部分肝小葉內(nèi)的肝細胞體積明顯增大，在肝細胞質(zhì)內(nèi) 有少量的脂滴空泡，細胞核偏向一側(cè)( 插頁ⅩⅩⅨ圖 3) ; 低強度運動組中肝小葉形狀規(guī)則，肝細胞體積明顯增大，在肝細 胞質(zhì)內(nèi)有大量的脂滴空泡( 插頁ⅩⅩⅨ圖 4) ; 中等強度運動組中肝小葉形狀規(guī)則完整，肝細胞排列整齊，呈條索狀排 列，肝細胞核圓居中，細胞質(zhì)均勻無脂肪沉積( 插頁ⅩⅩⅨ圖5) ; 高強度運動組中肝小葉形狀規(guī)則完整，肝竇正常，肝細胞排列整齊，呈條索狀排列，肝細胞核圓，位于細胞的中央， 細胞質(zhì)均勻無脂肪沉積( 插頁ⅩⅩⅨ圖 6) 。
3 討論
近年來，由于飲食習(xí)慣不合理而引發(fā)肥胖人群增多已經(jīng)成為一種普遍的社會現(xiàn)象。有研究報道［1，7］，肥胖人群中伴有 NAFLD 的約占到肥胖總?cè)藬?shù)的 70% 以上，因此有學(xué)者認為肥胖特別是中心性肥胖并伴有胰島素抵抗癥狀是 引發(fā)NAFLD的風(fēng)險因素。NAFLD 與體內(nèi)脂肪的穩(wěn)態(tài)失調(diào)
綜上所述，單純的****可以明確的降低血脂，改善 胰島素抵抗癥狀，但是對于**脂肪肝效果不明顯。當(dāng)配 合中等強度和高強度的運動后，可以改善肝細胞功能，在降 低血脂、改善胰島素抵抗的情況下，改善脂肪在肝臟內(nèi)的沉 積，實現(xiàn)標(biāo)本兼治。