蜂毒明肽對(duì)阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能的影響
呂延成， 林茂， 王敏， 田炳欣， 王春梅
【摘要】 目的 觀察蜂毒明肽對(duì)阿爾茨海默病( AD) 小鼠認(rèn)知功能的影響。方法 10 周齡昆明種雌性小鼠 60 只，隨機(jī)分成 6 組，每組 10 只，分別為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、AD 模型組、蜂毒明肽低劑量組、蜂毒明肽中劑量組、蜂毒明肽高劑量組。正常對(duì)照組不做任何處理，假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室注射生理鹽水。采用側(cè)腦室注射 β-淀粉樣肽25 － 35 ( β- amyloid protein，Aβ25 － 35 ) 法構(gòu)建 AD 小鼠模型。造模 14 d 后，蜂毒明肽干預(yù)的各組小鼠分別腹腔注射不同劑量的蜂毒明肽，連續(xù) 5 d。Morris 水迷宮測(cè)試認(rèn)知功能，**組化染色觀察海馬CA1 區(qū)Aβ25 － 35 的表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，蜂毒明肽各組和 AD 模型組小鼠逃避潛伏期時(shí)間較長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間較短，穿越平臺(tái)次數(shù)降低，海馬 CA1 區(qū) Aβ25 － 35 陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)( P 均 ＜ 0． 05) ，而假手術(shù)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P 均 ＞ 0. 05) 。蜂毒明肽中、高劑量組小鼠與 AD 模型組小鼠相比，前者逃避潛伏期有所縮短，目標(biāo)象限停留時(shí)間增加，穿越平臺(tái)次數(shù)有所增多，海馬 CA1 區(qū) Aβ25 － 35 陽(yáng)性表達(dá)有所減低( P 均 ＜ 0． 05) 。結(jié)論
蜂毒明肽能提高 AD 小鼠認(rèn)知功能，減少海馬 CA1 區(qū) Aβ25 － 35 的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】 蜂毒明肽; 阿爾茨海默病; 認(rèn)知功能; β-淀粉樣蛋白; CA1 區(qū)，海馬回
中圖分類(lèi)號(hào): Ｒ 749. 1 + 6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1674 － 8182( 2014) 06 － 0644 － 03
阿爾茨海默病( Alzheimer' s disease，AD) 作為一種臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性**，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。由于 AD 起病緩慢、病程長(zhǎng)、病因復(fù)雜，目前尚無(wú)良好的****和方法。蜂毒明肽( apamin) 是一種神經(jīng)**，其作為蜂毒各組分中分子量*小的神經(jīng)毒肽是蜂毒中重要的活性物質(zhì)之一。研究認(rèn)為，蜂毒明肽可提高正常鼠或海馬損傷鼠模型的空間記憶能力［1 － 2］，但對(duì)公認(rèn)的 AD 動(dòng)物模型的干預(yù)作用報(bào)道很少。本研究采用側(cè)腦室注射β-淀粉樣肽25 － 35 ( β- amyloid protein，Aβ25 － 35 ) 構(gòu)建 AD 小鼠模型，初步觀察蜂毒明肽對(duì) AD 小鼠模型認(rèn)知功能的影響，探討其作用機(jī)制，以期為 AD **尋找新的分子靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1． 1 材料 蜂毒明肽由廈門(mén)市英偉生物技術(shù)有限公司提供。10 周齡健康昆明種雌性小鼠60 只，SPF 級(jí)，體重 ( 20 ± 2 ) g，購(gòu)自廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心。Aβ25 － 35 和 Aβ25 － 35 抗體均購(gòu)自上海華壹生物科技有限公司。即用型**組化超敏 SP 試劑盒和 DAB 顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。DB001 型 Morris 水迷宮購(gòu)自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。CCD 顯微成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Pixera。
1． 2 方法
1． 2． 1 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)小鼠 60 只適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，按體質(zhì)量分層后隨機(jī)分為6 組( 每組10 只) : 正常對(duì)照組、假手術(shù)組、AD 模型組、蜂毒明肽低劑量組、蜂毒明肽中劑量組、蜂毒明肽高劑量組。正常對(duì) 照組小鼠不做任何處理，假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室注射生 理鹽水，蜂毒明肽組和 AD 模型組小鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射 4 μl 濃度為 1 mg / ml 的 Aβ25 － 35 溶液構(gòu)建 AD 動(dòng)物模型。14 d 后，按 10 ml / kg 的劑量，分別給蜂毒明肽低、中、高劑量組小鼠腹腔注射濃度為 0． 006、0． 02、
0. 04 mg / ml 的蜂毒明肽溶液，其余組注射等體積的生理鹽水，連續(xù) 5 d。
2． 2 Morris 水迷宮法測(cè)定小鼠認(rèn)知功能 造模 14 d后，每次腹腔注射蜂毒明肽 30 min 后進(jìn)行水迷宮測(cè)試，平臺(tái)置于第Ⅳ象限距離池壁 35 cm 處，水面高出玻璃平臺(tái)約 2 cm，水溫控制在( 20 ± 2) ℃ 。測(cè)試前1 d將讓小鼠熟悉水池環(huán)境，先將小鼠放入水池中讓其自由游泳 2 min，隨后引導(dǎo)其至玻璃平臺(tái)停留 10 s。( 1) 定位航行實(shí)驗(yàn): 將小鼠隨機(jī)從不同的象限置入池內(nèi)，小鼠到達(dá)玻璃平臺(tái)上 5 s 后終止記錄，如果小鼠 60 s 內(nèi)仍然不能找到玻璃平臺(tái)，則將其引導(dǎo)到玻璃平臺(tái)上停留 5 s。每次測(cè)試四個(gè)象限，每一象限測(cè)試間隔 10 min。記錄逃避潛伏期，即小鼠找到玻璃平臺(tái)的時(shí)間，連續(xù)測(cè)試 4 d。( 2) 空間探索實(shí)驗(yàn): 第5 d 時(shí)撤掉玻璃平臺(tái)，隨機(jī)定位一個(gè)入水點(diǎn)，使得所有待測(cè)試小鼠均在該點(diǎn)進(jìn)入水槽，記錄 60 s 內(nèi)小鼠在原目的象限內(nèi)停留時(shí)間和穿環(huán)次數(shù)即小鼠游經(jīng)原放置玻璃平臺(tái)位置的次數(shù)。
1． 2． 3 **組化 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠快速斷頭，取大腦，將腦組織在 4% 多聚甲醛磷酸鹽溶液中固定 24 h。于人字點(diǎn)前 3mm 處冠狀面取材。石蠟包埋后切片( 4 μm) ，常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)抗原，SP 法**組化染色，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。 PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。蛋白表達(dá)陽(yáng)性部位呈有別于背景的棕黃色，判定為陽(yáng)性。顯微圖像分析系統(tǒng) 分析并測(cè)定相對(duì)灰度值。
1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 16． 0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)
數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用 x珋± s 表示，組間比較采用 One-way ANOVA，兩兩比較方差齊時(shí)用 LSD-t 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用 Games-Howell 檢驗(yàn)。P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 各組小鼠認(rèn)知功能變化 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的各組小鼠認(rèn)知功能變化結(jié)果見(jiàn)表 1、表 2。與正常對(duì)照組比較，蜂毒明肽各組和 AD 模型組小鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間增長(zhǎng)、目的象限停留時(shí)間減短、穿環(huán)次數(shù)有所減少( P 均 ＜ 0． 05) 。而假手術(shù)組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P 均 ＞
0. 05) 。與 AD 模型組相比較，蜂毒明肽各劑量組小
鼠的平均逃避潛伏期有所縮短，目的象限停留時(shí)間有所延長(zhǎng)，穿環(huán)次數(shù)有所增加，其中蜂毒明肽中劑量組和高劑量組變化明顯( P 均 ＜ 0． 05) 。
2． 2 各組小鼠海馬 CA1 區(qū) Aβ25 － 35 的表達(dá) Aβ25 － 35
在腦組織神經(jīng)元中的表達(dá)主要定位于胞膜和胞質(zhì)中， 呈有別于背景的棕黃色。**組化結(jié)果顯示，正常對(duì) 照組與假手術(shù)組有少數(shù)淡黃色陽(yáng)性染色顆粒，陽(yáng)性表 達(dá)不明顯; 蜂毒明肽各組和 AD 模型組鏡下可見(jiàn)棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性染色顆粒。與 AD 模型組比較，蜂毒明肽各組 Aβ25 － 35 的表達(dá)較弱。見(jiàn)圖 1。平均灰度值分析顯示，與正常對(duì)照組相比，蜂毒明肽組和 AD 模型組Aβ25 － 35 表達(dá)有所增加( P均 ＜ 0 ． 05 ) ，而假手術(shù)組未見(jiàn)差異( P ＞ 0． 05) 。與 AD 模型組相比，蜂毒明肽各組小鼠海馬 CA1 區(qū) Aβ25 － 35 的表達(dá)減少，其中蜂毒明肽中、高劑量組變化較明顯( P 均 ＜ 0． 05) 。見(jiàn)圖 2。
3 討論
AD 作為一種危害老年人身體健康的神經(jīng)系統(tǒng)**，給社會(huì)與患者家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。由于 AD 起病隱秘，病因復(fù)雜，到目前為止，臨床上尚缺乏有效的防治 AD 方法和**。Aβ 過(guò)度表達(dá)和沉積已被公認(rèn)為是 AD 發(fā)生、發(fā)展的主要原因 ［3］。因此，如何減少Aβ 過(guò)度表達(dá)已經(jīng)成為防治 AD 研究的熱點(diǎn)之一。蜂毒明肽作為蜂毒中重要的多肽之一，約占蜂毒干質(zhì)重的 1% ～ 2% ，被認(rèn)為是一種很強(qiáng)的神經(jīng)**，其可以通過(guò)血腦屏障，直接作用于**神經(jīng)系統(tǒng)［4 － 5］。張愛(ài)提等［6］對(duì)中華蜜蜂蜂毒明肽基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其存在較明顯的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽序列，具有生物**肽的特性。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)蜂毒明肽可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)腎上腺素或者改變細(xì)胞膜上的離子通道繼而提高認(rèn)知功能［1 － 2］，但其對(duì)公認(rèn)的 AD 模型動(dòng)物干預(yù)作用國(guó)內(nèi)報(bào)道還很少見(jiàn)。
本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，AD 模型組小鼠的逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，在目標(biāo)象限停留時(shí)間減少，穿越平臺(tái)的次數(shù)減少，海馬 CA1 區(qū)Aβ25 － 35 表達(dá)增多。而采用蜂毒明肽干預(yù)的各組小鼠較 AD 模型組小鼠逃避潛伏期有所縮短，在目標(biāo)象限停留時(shí)間有所延長(zhǎng)，穿環(huán)次數(shù)增多，海馬 CA1 區(qū)Aβ25 － 35 陽(yáng)性表達(dá)減弱。說(shuō)明蜂毒明肽能減少海馬CA1 區(qū)Aβ25 － 35 的表達(dá)，繼而提高 AD 小鼠認(rèn)知功能，改善 AD 病程，其分子機(jī)制可能與其特異性阻斷小電導(dǎo)鈣激活性鉀通道有關(guān)［7］。